La inoculación es el proceso de introducir las esporas o micelio en el medio de cultivo estéril.
Primero preparamos los tarros con puerto de inyección y perlón para intercambio gaseoso. Una vez lleno de sustrato (centeno es el patrón oro de los granos) a 2/3 de su capacidad. Si los tarros no son herméticos ponemos una capa de aluminio sobre el tarro abierto y lo perforamos con un lápiz en la zona del perlón para evitar que puedan entrar contaminantes. Esterilizamos en olla a presión.
Una vez hecho esto procedemos a inocular; lo haremos en una caja de aire inmóvil dejando fuera de la caja un mechero de alcohol prendido, usaremos guantes de exploración que son más baratos y nos frotamos bien con Sterilium dentro de la caja.
Pinchamos a través del puerto de inyección 1-2ml por tarro. Entre cada tarro sacamos fuera la jeringa de esporas o jeringa de micelio y pasamos la aguja por el mechero, introduciéndola a la caja aún al rojo vivo y enfriamos tirando un poco de líquido. No limpiar con alcohol ya que es un vector de contaminación.
Aquí podemos ver como se realiza esta tarea ( www.mushroomvideos.com ):
Una vez realizada la inoculación procedemos al proceso de incubación.
Inoculamos una jarra de 250ml de semillas de centeno o comida de pájaros. Cuando esté completamente colonizado agitamos la jarra para soltar los granos unos de otros, para ello podemos golpearla contra un neumático de bicicleta completamente hinchado. No hacer esto si el tarro está roto por algún sitio o estallará pudiendo producir cortes.
Esterilizamos agua destilada (olla a presión) en una jarra con intercambio gaseoso. Una vez enfriada y en una caja de aire inmóvil o frente a una cámara de flujo laminar vertimos 2/3 del agua esterilizada en el bote de grano colonizado que agitamos previamente. Agitamos bien y devolvemos el agua al bote donde esterilizamos el agua, con cuidado de que no caiga ningún grano, para ello podemos usar la tapa del bote.
Ahora tenemos en el bote de agua concentrada de micelio, donde crece lentamente al no tener oxigenación. Para usarlo se pasa a jeringas diluyéndolo dos o incluso tres veces. Se deben agitar las jeringas a diario para oxigenación; si crece algo en la superficie que no es de color blanco níveo es que algo está mal. Los contaminantes suelen mostrar un color grisáceo o azul claro en la superficie.
Esta técnica de RR es mucho mejor que usar Honey tek y podemos sacar cientos de jeringas a partir de un solo tarro en un tiempo mucho menor. Además, en caso de contaminación será más fácil darse cuenta observando la jeringa.
Para disminuir el riesgo de contaminantes a la hora de inocular una buena opción es hacer al menos un par de puertos de inyección para la tapa del tarro cerca de los bordes. Hacemos los agujeros (al menos 2) con un destornillador y un martillo y lo tapamos con silicona, poniendo un buen pegote de forma que se adhiera bien a la superficie alrededor del agujero, dejando secar bien al aire libre. Debemos usar una silicona que resista las altas temperaturas de la olla a presión, preferiblemente silicona RVT (de color rojo).
A la hora de esterilizar en la olla a presión es conveniente tapar con aluminio el tarro para evitar que se produzca olor a silicona.
Reverso puerto de inyección de silicona
Puerto de inyección, correcto a la izqda. e incorrecto a la drcha.
Esta técnica consiste en poner una capa de vermiculita entre dos papeles de aluminio para tapar los tarros de sustrato antes de esterilizar en olla a presión o al baño maría.
De esta forma se crea una capa estéril y sin nutrientes que atrapa los posibles contaminantes de la aguja al inocular. Puede ser usado conjuntamente o en sustitución de un puerto de inyección. Si no vamos a usar glovebox es necesario usar al menos uno de estos métodos.
Sello Ramsey
Una vez que ponemos la vermiculita, tapamos con otra capa de papel de aluminio y cerramos el bote. Podemos asegurarlo con una goma elástica ancha (las venden en papelerías) para mayor seguridad.